2020-05-11
2020年5月11日，上海邦耀生物科技有限公司（下稱邦耀生物）與華東師范大學密切合作，為打破現有堿基編輯技術效率瓶頸，通過融合單鏈DNA結合蛋白的功能域開發了一系列超高活性的新型胞嘧啶堿基編輯器（命名為：hyCBE）。相對于已報道的CBE，在人類細胞系及小鼠胚胎中其活性均顯著提高并可以編輯到靠近PAM區的堿基。更令人振奮的是，活性的提高并沒有增加DNA及RNA脫靶風險，并且在基因治療等表現出非常廣闊的應用前景。相關成果于2020年5月11日在線發表于國際著名學術期刊Nature Cell Biology。這也是邦耀生物繼發表在 Cell Research、Nature Medicine 等期刊的基因治療重磅成果后，在基因編輯領域開發核心堿基編輯工具的開篇之作。
據ClinVar數據顯示，人類的遺傳病中58%是由于單個堿基突變引起的。雖然Cas9激活的同源重組可以實現對突變位點的精確修正，但效率非常低（0.1%~5%），嚴重阻礙了其應用。而通過將胞嘧啶脫氨酶與nickase Cas9（D10A）融合而成的胞嘧啶堿基編輯器BE3(Cytosine base editor, CBE),在不引入DNA雙鏈斷裂同時也不需要重組修復模板的情況下對編輯窗口（距離PAM遠端起的第4-7位）內的胞嘧啶脫氨，實現C>T的堿基轉換，具有更加安全、高效、精準的特點。在基因治療，農作物遺傳育種，藥物篩選等領域展示了廣泛的應用前景。
自CBE被報道以來，已有多種策略對其進行了優化改進。例如在提高活性方面，主要是通過密碼子優化及增加更強的核定位信號、用高活性的胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A或Anc689替換APOBEC1、融合額外的UGI增加編輯效率和產物純度。而通過對脫氨酶的分子進化獲得的evoAPOBEC1-BE4max大幅提高針對GC motif中胞嘧啶的編輯效率。雖然這些方法一定程度上提高了CBE的活性，但是對于編輯窗口的影響不大，特別是更靠近PAM序列的堿基仍然很難被編輯到。因此，是否有新的策略可以提高編輯活性而又能擴增靶向堿基的范圍，一直是堿基編輯器優化的難點。
由于CBE主要是以單鏈DNA（ssDNA）為底物，因此研究團隊猜測如果增強脫氨酶與ssDNA的結合能力，是否能增加脫氨酶作用時間而增強活性呢？于是，通過對10個非序列特異性的ssDNA結合結構域（ssDBD）與CBE進行融合，通過篩選，發現將Rad51蛋白的ssDBD融合到APOBEC1與Cas9n之間能顯著提高堿基編輯活性，同時編輯窗口也大幅增加（圖1）。通過10個靶點的分析，在編輯窗口C4-C8中，hyBE4max比BE4max活性提高了1.5-2倍，而在C9-C15這些更靠近PAM的堿基中，活性最多提高了18倍。
圖1. hyCBE模式圖及對不同ssDBD的篩選結果
為了驗證融合ssDBD的策略是否具有通用性，用類似的方法改造A3A-BE4max和特異性識別TC motif中C堿基的eA3A-BE4max,獲得了hyA3A-BE4max和hyeA3A-BE4max。通過大量的實驗證明，相比A3A-BE4max，hyA3A-BE4max活性在C3-C11位點提高了1.2-2倍，C12-C17位點活性提高3-4倍，通過小鼠胚胎顯微注射也進一步證明其在編輯更靠近PAM序列的堿基的獨特優勢。與eA3A-BE4max相比，hyeA3A-BE4max仍然能非常特異性地靶向TC motif中的C，編輯窗口由C4-C9拓展為C4-C15，活性最高提高了257倍；而在小鼠胚胎中靶向Dmd基因時，C13位點編輯效率也大大提高，F0小鼠平均編輯活性提高了近60倍，F0代小鼠獲得Dmd純合點突變的效率達到40%。
論文進一步驗證hyCBEs特別是hyeA3A沒有檢測到DNA或者RNA層面的脫靶，具有非常高的精準性。最后，通過比較多種CBE在編輯胎兒血紅蛋白（HBG1/2）啟動子-117位點的能力發現，hyeA3A能在紅細胞前體細胞系中精確催化-117G>A的轉換，而與周圍同時發生堿基突變（bystander mutation）的細胞相比，具有更高的HBG表達水平，展示了hyeA3A-BE4max對于精準治療β-血紅蛋白病的巨大潛力。該工作開發了能提高編輯活性及拓寬靶點范圍的一系列新的CBE，為基礎研究與基因治療提供了新的優化工具。
據了解，今年1月份，劉明耀教授和李大力教授團隊已經率先證明單堿基編輯器編輯技術靶向HBG啟動子激活胎兒期血紅蛋白的表達，對于治療β地中海貧血的可行性與有效性，相關研究發表在國際著名學術期刊Cell Research；同年3月份國際著名學術期刊Nature Medicine又在線發表了邦耀生物科學家吳宇軒博士證明單堿基編輯技術可以靶向BCL11A的紅系增強子原件激活胎兒期血紅蛋白，或者編輯β血紅蛋白基因的特定突變，有望通過編輯自體造血干細胞治療包括β地貧在內的β血紅蛋白病。而最新自主研發的hyCBEs系列工具擁有更高的編輯活性和更寬的編輯窗口，對于β血紅蛋白病的治療具有更大的優勢。邦耀生物正著力圍繞這幾項自主技術開展臨床轉化。
據統計，在我國β-地中海貧血的患病率是2.21%，其類型達48種。基因編輯技術介導的基因治療是精準醫學領域的一大突破，利用單堿基編輯技術重新激活胎兒血紅蛋白的表達，也為β-地中海貧血的個性化治療提供了可能性。
邦耀生物聯合創始人、總裁席在喜先生透露：邦耀生物已搭建了創新、高效的基因編輯平臺，今天開發的超高活性的單堿基編輯器將會為基因治療再添利器，邦耀生物著眼于基因藥物和細胞藥物的開發，目前已與國內多家醫療單位合作，在遺傳疾病及惡性腫瘤的研究中取得了階段性突破。除堅實的基礎研發實力外，邦耀生物還擁有經驗豐富的工藝研發與生產團隊及6000平米GMP級別中試基地，能夠將創新成果及時迅速進行轉化并推向臨床！邦耀生物布局于劃時代的基因與細胞藥物領域，并致力于改寫和引領中國新一代藥企在全球生命科技領域格局！
