2018-07-10
前言
近幾年來，免疫治療迎來了空前盛世，不可否認的是，在已過去一半的2018年里，它依然是大家關注的焦點，層出不窮的報道相繼而來，讓更多的腫瘤患者看到了治愈的希望！然而，在風光無限好的背后，不少科學家也洞悉到：目前的大多數免疫療法的臨床響應率還停留在20%左右的低水平。究其根源，原來在于腫瘤建立的免疫抑制微環境。近日，來自華東師范大學、邦耀實驗室的科學家團隊發現：GPCR家族成員--Lgr4在腫瘤免疫調節中扮演著關鍵作用，以其作為治療靶點將為腫瘤免疫治療提供一個新的視角。
2018年7月2日，國際著名腫瘤學期刊Cancer Research 在線發表了題為“Inhibition of Rspo-Lgr4 facilitates checkpoint blockade therapy by switching macrophage polarization”的研究成果[1]。華東師范大學生命科學學院院長、邦耀生物首席科學家劉明耀教授及杜冰教授為該文共同通訊作者，華東師大博士后譚炳合為該文第一作者。
研究背景
GPCR（G protein-coupled receptors）為G蛋白偶聯受體，它在人體內分布廣泛，功能復雜，參與調控眾多生理過程如心血管、神經、免疫、代謝和內分泌系統等。Lgr4是富含亮氨酸基序的GPCR家族成員，多年來被認為是通過結合R-spondin分泌蛋白，促進和放大經典的wnt/β-catenin 信號通路[2,3]，廣泛在個體和器官發育[4,5]乃至腫瘤細胞轉移[6]方面發揮重要調控作用。然而關于Lgr4對于腫瘤免疫微環境的調控作用仍是個未解之謎。
劉明耀教授團隊長期以來專注于GPCR信號轉導研究與新藥研發工作，先后發現了GPR54、GPR116以及LGR4等一系列GPCR家族重要成員在腫瘤發生、發展中的重要調控作用，尤其是對于Lgr4的研究在國際上取得了十分重要的影響。
如2016年發表在Nature medicine雜志上[7]，首次揭示Lgr4作為RANKL蛋白的受體在哺乳動物的噬骨/成骨平衡過程中發揮關鍵作用，以此為基礎開發了基于Lgr4受體封閉的骨質疏松治療手段；而在2013年發表在JBC雜志上的研究發現Lgr4可以通過cAMP/PKA/CREB信號通路調控固有免疫系統中TLR2/4介導的模式識別功能[8]。
在2018年5月，最新發表在FASEB J.上的文章也表明，Lgr4在乳腺癌的發生發展、轉移及干細胞分化上具有重要的調控作用[9]。而這些工作均提示我們Lgr4與腫瘤及免疫微環境之間重要聯系。
雖然近年來腫瘤免疫療法取得了突破性的進展，然而無論是對于免疫檢查點阻斷療法還是CAR-T細胞療法，實體瘤內部免疫抑制的腫瘤微環境Tumor immune microenvironment (TIME)始終是難以逾越的障礙。如腫瘤微環境中PD-L1等T細胞抑制信號的大量表達，抑制性細胞如調節性T細胞（Treg）、髓系來源抑制細胞（MDSC）、M2型巨噬細胞以及IL-10、TGF-β等免疫抑制分子在腫瘤微環境中也發揮著獨特的免疫抑制作用。此外，復雜的免疫細胞互作網絡也使腫瘤微環境成為限制免疫療法效果發揮的一道堅硬壁壘。
腫瘤微環境TIME的分類，來自nature medicine[10]
正是基于對腫瘤免疫抑制微環境調控的關注以及對于GPCR功能和信號通路研究堅實基礎，劉明耀團隊利用高通量測序技術對與腫瘤免疫抑制微環境相關的GPCR開展了大規模篩選，進而發現了與腫瘤相關巨噬細胞功能密切相關的受體Lgr4，并對其在腫瘤微環境的重塑和抗腫瘤免疫應答中的重要作用開展了深入的研究。
研究成果
1. 首先在細胞水平證明，Lgr4是維持巨噬細胞促腫瘤狀態的“穩定器”；在Lgr4敲除的骨髓來源巨噬細胞中發現，Lgr4的敲除引起巨噬細胞中M2（促腫瘤）相關基因的表達下調；與此同時，M1（促炎型）相關基因表達上調，巨噬細胞表現為典型的促炎表型；
2. 在Lgr4條件敲除的小鼠體內，發現腫瘤生長被抑制；鑒于巨噬細胞功能性極化與腫瘤發生的密切關系，通過在Lgr4條件敲除（巨噬細胞特異性）的小鼠中建立腫瘤模型，發現小鼠中腫瘤的生長被強烈地抑制，且存活時間也顯著延長；并且在Lgr4條件敲除小鼠的腫瘤組織中發現存在大量M1型巨噬細胞和活化的CD8+ T細胞浸潤。而在B16F10黑色素瘤小鼠模型中也發現了非常一致的現象。這就證實了Lgr4的存在有利于M2型腫瘤相關巨噬細胞功能和表型的維持，并且這種調控作用對于獲得性免疫系統中CD8+ T細胞的募集以及腫瘤微環境的維持是至關重要的。
3. Lgr4與巨噬細胞表型調控在腫瘤治療中的具有很大應用潛力；通過將Lgr4的胞外段蛋白以及Rspondin1（Lgr4配體）抗體注射到荷瘤小鼠體內，發現Lgr4胞外段蛋白和Rspondin1（Lgr4配體）抗體均能顯著抑制了鼠LLC肺癌以及B16F10黑色素瘤的生長；并顯著提高腫瘤微環境中M1型巨噬細胞的比例以及CD8+ T細胞的浸潤和激活水平，證明Lgr4的阻斷有效改變了腫瘤微環境的細胞構成，抑制腫瘤的發生發展，具有廣泛的抗腫瘤作用。
4. Lgr4阻斷劑與PD-1抗體聯用，治療腫瘤效果顯著；分別對LLC和B16F10腫瘤模型小鼠進行單藥和聯藥治療實驗。與已報道的臨床結果相似，無論是對于LLC肺癌模型還是B16F10黑色素瘤模型，單獨使用PD-1抗體的療效非常有限，而一旦與Lgr4胞外段蛋白聯用，則表現出顯著的腫瘤抑制效果；進一步的腫瘤內分析也顯示Lgr4阻斷劑與PD-1抗體聯用明顯促進了抗腫瘤免疫細胞的浸潤，甚至使原先屬于“冷”腫瘤的LLC肺癌變為“熱”腫瘤，增強了其對免疫檢查點抑制劑治療的敏感性。
Lgr4通過激活ERK/STAT3信號通路對巨噬細胞M2方向分化的正調控作用[1]
結論：該論文首次揭示G蛋白偶聯受體（GPCR）家族成員Lgr4在腫瘤免疫調節中的關鍵作用，提出并驗證了以Lgr4為作用靶點的腫瘤免疫治療策略。該工作的一大亮點是創造性地將Lgr4阻斷劑與PD-1抗體聯用，有效地遏制了腫瘤細胞對于單純免疫檢查點封閉療法的耐受，在小鼠LLC肺癌和B16F10黑色素瘤模型中取得了讓人欣喜的治療效果。
成果轉化
綜上所述，邦耀科學家劉明耀教授和杜冰教授團隊揭示了Lgr4在腫瘤免疫及腫瘤微環境調節中的作用機制，擴展了人們對Lgr4生理功能調控作用的認識，同時為當前炙手可熱的腫瘤免疫療法提供了又一行之有效的作用靶點和治療策略，具有很大的臨床轉化潛力。
邦耀生物有幸和華師大的科學家們一起參與腫瘤免疫療法的研發，目前，上海邦耀生物也已于與華師大共建了“上海基因編輯與細胞治療研究中心”，正在積極開展腫瘤免疫療法的基礎和轉化研究，針對這一重大突破，邦耀和華師大已聯合申請多項專利。相信Lgr4在腫瘤免疫微環境中調控功能的發現，會為腫瘤免疫療法在實體瘤上的應用提供新的思路，未來邦耀公司將結合自己強大的CART細胞治療和基因編輯技術平臺，進一步擴展Lgr4在腫瘤免疫治療中的應用前景。
參考文獻：
1.Tan B, Shi X, Zhang J, Qin J, Zhang N,Ren H, et al. Inhibition of Rspo-Lgr4facilitates checkpoint blockade therapy by switching macrophage polarization.Cancer Research 2018
2.CarmonKS, Gong X, Lin Q, Thomas A, Liu Q. R-spondins function as ligands of theorphan receptors LGR4 and LGR5 to regulate Wnt/beta-catenin signaling. ProcNatl Acad Sci U S A 2011;108:11452-7
3.CarmonKS, Gong X, Yi J, Thomas A, Liu Q. RSPO–LGR4 functions via IQGAP1 to potentiateWnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences 2014;111:E1221
4.MendiveF, Laurent P, Van Schoore G, Skarnes W, Pochet R, Vassart G. Defectivepostnatal development of the male reproductive tract in LGR4 knockout mice.Developmental biology 2006;290:421-34
5.Planas-PazL, Orsini V, Boulter L, Calabrese D, Pikiolek M, Nigsch F, et al. The RSPO–LGR4/5–ZNRF3/RNF43 module controls liver zonationand size. Nature Cell Biology 2016;18:467
6.GongX, Yi J, Carmon KS, Crumbley CA, Xiong W, Thomas A, et al. Aberrant RSPO3-LGR4 signaling in Keap1-deficient lungadenocarcinomas promotes tumor aggressiveness. Oncogene 2014;34:4692
7.LuoJ, Yang Z, Ma Y, Yue Z, Lin H, Qu G, etal. LGR4 is a receptor for RANKL and negatively regulates osteoclastdifferentiation and bone resorption. Nature medicine 2016;22:539
8.DuB, Luo W, Li R, Tan B, Han H, Lu X, etal. Lgr4/Gpr48 negatively regulates TLR2/4-associated pattern recognitionand innate immunity by targeting CD14 expression. The Journal of biologicalchemistry 2013;288:15131-41
9.Yue Z, Yuan Z, Zeng L, et al. LGR4 modulatesbreast cancer initiation, metastasis, and cancer stem cells. FASEB J. 2018May;32(5)
10.Binnewies M, Roberts EW,Kersten K, et al. Understanding thetumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nat Med. 2018May;24(5)
