2022-10-14
堿基編輯技術最早由哈佛大學David R. Liu團隊開發，主要分為兩類：胞嘧啶堿基編輯器(CBE)與腺嘌呤堿基編輯器(ABE)，分別由胞嘧啶脫氨酶或改造的腺嘌呤脫氨酶與Cas9酶活突變型蛋白（nickase Cas9）融合而來。目前，CBE與ABE雖已在多個物種中得到廣泛應用。然而通過不少實驗研究表明它們仍存在嚴重的隨機脫靶現象，未得到完全解決。
2022年10月14日，聚焦于基因和細胞治療的上海邦耀生物科技有限公司（以下簡稱“邦耀生物”）宣布，與華東師范大學李大力教授及劉明耀教授團隊合作開發并命名了一種精準且安全的新型腺嘌呤堿基編輯器——“ABE9”，能夠有效解決ABE臨床應用存在的各類脫靶隱患和安全性問題，理論上將為近50%遺傳致病性SNVs的糾正提供了新的精準靶向工具。該項研究成果于10月13日正式在國際學術期刊Nature Chemical Biology上發表。可以說，這一發現對提升ABE工具的安全性，拓寬其適用范圍，推動其在基因治療中的應用及后續的臨床轉化均具有重要意義。
值得一提的是，ABE9作為新一代最具有臨床適用性的產品，已提前完成核心專利申請，未來專利布局將覆蓋全球主流市場。目前，邦耀生物在ABE技術領域擁有持續而深厚的專利布局積累，在全球范圍內已獲得授權的堿基編輯器專利達多個同族。
新型腺嘌呤堿基編輯器“ABE9”：精準且安全，臨床應用潛力巨大
DNA堿基編輯器由于可以在不產生DNA雙鏈斷裂(DSB)、不需要供體DNA模板的情況下高效地催化堿基轉換，在種質改良和基因治療中被寄予厚望。然而由David R. Liu團隊開發的初代ABE7.10的編輯效率對于很多靶點而言卻不盡如人意，雖然David Liu等課題組通過分子進化獲得了更高活性的ABE8（ABE8e 和ABE8s），但是ABE一些固有的缺陷卻并沒有解決。例如，ABE引起的大量隨機的RNA脫靶編輯，由于編輯窗口較寬引起非目標堿基改變而產生旁觀者效應以及ABE會在特定的TCN motif的堿基序列中誘發胞嘧啶堿基轉換。
該研究首先證明了高活性的ABE8e引發了更嚴重的旁觀者效應以及Cas9非依賴的DNA和RNA脫靶，而且對于胞嘧啶的編輯效率顯著提高。為了解決ABE8e的精準性問題，該研究基于ABE8e的冷凍電鏡結構進行理性設計和篩選，發現在TadA-8e脫氨酶的活性口袋引入關鍵突變L145T和N108Q（ABE9）可在保留高編輯活性的同時，顯著縮小編輯窗口到sgRNA的第5-6位的腺嘌呤，消除對胞嘧啶的編輯活性（圖1）。
圖1：TadA-8e蛋白結構及ABE9編輯特性評價
通過鑒定Cas9非依賴性脫靶的R-Loop檢測以及RNA脫靶的轉錄組深度測序，發現ABE9幾乎不引起隨機的DNA和RNA脫靶編輯（圖2），展示出了極高的應用安全性。此外，ABE9在小鼠和大鼠胚胎中展示了極高的體內編輯精度和活性。在所有的F0代小鼠中，對照組ABE8e在編輯A5目標位點的同時引起了大量的A8位的旁觀者編輯（18/19只），精確編輯A5位的小鼠僅占5.1%。而ABE9可以精準編輯A5（14/16只），其中25%小鼠的編輯效率超過80%， 所有F0小鼠的平均效率達到54.3%。同樣，ABE9在大鼠中能夠靶向Gaa基因精準產生D645G突變而誘發龐貝氏病，F0代大鼠中僅含目的位點A6-to-G突變的達到48.41%，而ABE7.10的精準編輯只占2.76%。嚙齒類動物的體內實驗再次證明了ABE9高精度特性，也凸顯了其在精準構建動物模型的潛力（圖3）。
圖2：Cas9非依賴DNA 脫靶和RNA脫靶評價
圖3：ABE9動物體內編輯及糾正人類致病性的SNVs
另外，為進一步評估ABE基因治療的潛能，研究者構建含有人類致病性SNVs的細胞系，且需糾正的腺苷處于sgRNA第五位且處于多個連續腺苷中。結果表明，即使面對這樣極端富含旁觀者堿基的序列中，ABE9也能精準編輯sgRNA第五位產生A-to-G的轉換，精確糾正能力相較于ABE8e最大提高了342.5倍（圖3）。
論文共同通訊作者，邦耀生物聯合創始人&副總裁李大力教授表示：“在本次研究中，為了無差別的分析海量靶點中ABE9的精準編輯特性，采用8000多條sgRNA與靶點配對的文庫進行編輯窗口的分析，發現ABE9非常精準且無序列偏好地主要編輯A5-A6兩位堿基，證明其廣泛地精準編輯特性。總的來說，ABE9將編輯窗口縮窄至1-2nt，幾乎完全消除了對胞嘧啶的脫靶編輯，更重要的是將DNA /RNA脫靶事件降低到背景水平，實現了高精度、低脫靶的堿基編輯，將來還可以與識別不同PAM的Cas變體融合，進一步擴大靶向范圍，不僅為基礎研究帶來新的堿基編輯工具，更為重要的是有望極大提高將來臨床應用的安全性。”
深耕基因治療領域，邦耀生物突破不斷
邦耀生物作為一家全球最早進行基因編輯技術研發和應用的企業之一，自成立以來一直堅持技術創新，不僅不斷克服行業壁壘進行多管線戰略布局，同時致力于開發國際領先的基因編輯工具，獲得具有自主知識產權的核心技術?；厥装钜锏拈_拓之路，無疑是一段不斷突破與創新的過程。目前，邦耀生物科學家團隊在基因編輯工具開發、基因治療地中海貧血以及CAR-T技術創新領域，已經取得很多重磅、突破性進展：
2019年3月，Nature Medicine發文，發現利用基因編輯技術靶向編輯BCL11A紅系增強子，會重新開啟γ珠蛋白表達，代替有缺陷的β珠蛋白，有望達到根治β-地中海貧血目的；
2020年1月，Cell Research發文，率先證明單堿基編輯器編輯技術靶向HBG啟動子激活胎兒期血紅蛋白的表達對于治療β-地中海貧血的可行性與有效性；
2020年3月，Nature Medicine發文，證明單堿基編輯技術可以靶向BCL11A的紅系增強子原件激活胎兒期血紅蛋白，或者編輯β血紅蛋白基因的特定突變，有望通過編輯自體造血干細胞治療包括β-地中海貧血在內的遺傳性血液疾??；
2020年5月，Nature Cell Biology發文，報道自主研發的hyCBEs系列工具擁有更高的編輯活性和更寬的編輯窗口，對于β血紅蛋白病的治療具有更大的優勢；
2020年6月，Nature Biotechnology發文，開發一種全新的具有高特異性且安全的雙功能堿基編輯器A＆C-BEmax；
2022年8月，Nature Medicine發文，公布了詳細的臨床數據，邦耀生物BRL-101基因治療地中海貧血癥患兒脫離輸血依賴已超過2年，并更為全面地解讀了BRL-101治療患者的療效和安全性特征；
2022年8月，Nature發文，證明了邦耀生物BRL-201非病毒PD1定點整合CAR-T療法出色的臨床安全性和有效性，使NHL患者無癌生存期最長超過2年。
對此，邦耀生物創始人&董事長劉明耀教授表示，“本次高效精確的新型腺嘌呤堿基編輯器ABE9的開發，為單堿基編輯工具ABE在活性窗口和RNA脫靶風險兩方面的協同優化提供了全新的思路。而邦耀生物自2020年以來，在堿基編輯器及其在基因治療遺傳疾病中的一系列突破性進展，將會為基因治療再添利器。目前，邦耀生物已與國內多家醫療單位合作，在基因編輯治療β-地中海貧血癥、非病毒PD1定點整合CAR-T、以及UCART等項目中已經取得優異臨床效果。未來，仍將通過不斷地加速推進創新藥物的轉化與落地，從而造福包括地中海貧血在內的全球罕見遺傳疾病及惡性腫瘤患者！”
