2022-11-11
目前已知的人類遺傳疾病約60%是由堿基突變引起的，因此開發高效精準且安全的單堿基編輯器對基礎研究和人類遺傳疾病的治療具有極為重要的意義。
2022年11月11日，聚焦于基因和細胞治療的上海邦耀生物科技有限公司（以下簡稱“邦耀生物”）宣布，與華東師范大學李大力教授、劉明耀教授團隊以及北京大學的伊成器課題組合作發現了一種可以大幅提升基因編輯準確性和安全性的技術。研究團隊通過對腺嘌呤脫氨酶TadA-8e重新設計改造，改變了其對底物的識別和催化，變成僅編輯胞嘧啶的脫氨酶，創新性地開發了不依賴天然胞嘧啶脫氨酶AID/APOBEC家族的一系列精準且安全的新型胞嘧啶堿基編輯器——“Td-CGBE/Td-CBEs”(TadA-derived CGBE/CBEs)，與目前最優化的胞嘧啶堿基編輯器BE4max相比，展現出了非常低脫靶編輯和indel事件，具備巨大的臨床轉化應用潛力。該項研究成果已于11月10日正式在國際學術期刊Nature Biotechnology上發表。
Nature Biotechnology發文
邦耀生物新型胞嘧啶堿基編輯系統：“Td-CGBE/Td-CBEs”臨床應用前景廣闊
近年來，隨著CRISPR/Cas9技術的發展，單堿基編輯技術因其高效和精確的基因編輯能力，成為當前最有希望治愈各種遺傳疾病的明星工具。
堿基編輯技術最早由哈佛大學David R. Liu團隊開發，他們通過將Cas9缺口酶（nickase）與APOBEC家族胞嘧啶脫氨酶以及通過分子進化得到的腺嘌呤脫氨酶TadA融合，開發出可實現C到T堿基轉換的胞嘧啶堿基編輯器（Cytosine base editor, CBE）以及A到G堿基轉換的腺嘌呤堿基編輯器（Adenine base editor, ABE）。這兩類堿基編輯器能不依賴DNA雙鏈斷裂和同源重組修復機制，在分裂及非分裂細胞基因組DNA上實現高效的堿基轉換。目前CBE與ABE雖已在多個物種中得到廣泛應用，但通過不少實驗研究表明，它們仍在安全性等方面存在隱患。如現有的CBE會產生顯著的不依賴于Cas9的DNA和RNA隨機脫靶，而且較寬的編輯窗口引起難以避免的旁觀者效應。
在本次研究中，科研團隊首先證明了ABE尤其是高活性ABE8e可介導高效的胞嘧啶編輯，由此開發了首款不依賴于天然AID/APOBEC家族酶的CGBE，命名為Td-CGBE（TadA-derived CGBE）。項目組基于結構導向的理性設計和篩選，發現在TadA-8e脫氨酶的活性口袋引入關鍵突變N46L，消除其固有的腺嘌呤脫氨酶活性而展現高效的胞嘧啶編輯活性，隨后在27個靶點（包括4個富含多A的靶點）的測試進一步證明了該突變可完全消除腺嘌呤編輯活性，誘導高效率高純度的C到G的轉換，效率高達72.8%。令人驚喜的是，其相對于傳統的CGBE編輯器，該突變體具有更低的indels，且編輯窗口顯著縮窄到1-2個堿基 (C5-C6)。（圖1）
隨后，項目組通過對TadA-8e結構中可能與底物相互作用的關鍵區段重新改造、linker序列以及UGI串聯等多輪優化獲得了一系列Td-CBEs，發現其依然表現為完全消除腺嘌呤編輯的特性，而且產生顯著降低的indels頻率。研究發現在Td-CBE的基礎上去除linker序列并在TadA-8e-N46L的基礎上引入P29A（eTd-CBEa）或A48M（eTd-CBEm）可保留較高的C到T編輯活性，并且顯著縮小編輯窗口到sgRNA的第5或第6位，與基于APOBEC1來源的窄窗口BE4max-YEE相比，eTd-CBEs變體的精確度最高提升了131.4倍，且僅誘導背景水平的indels事件（圖2）。可以說，Td-CGBE高精確度的特性為進一步開發精準的C到T的堿基編輯器奠定基礎，能夠解決傳統CBE的精準性問題。
圖2：Td-CBEs的優化及特性評價
此外令人興奮的是，通過Cas9依賴性的脫靶位點、Cas9非依賴性脫靶的R-loop檢測和項目組前期開發的最靈敏的Detect-seq 以及RNA脫靶的轉錄組分析發現，Td-CGBE/Td-CBEs變體幾乎不引起隨機的DNA和RNA脫靶編輯（圖3），展示出了極高的應用安全性。并且Td-CGBE在小鼠胚胎中也表現出極高的體內編輯活性和精度。
圖3：Cas9非依賴DNA 脫靶、detect-seq和RNA脫靶評價
為進一步評估Td-CGBE/Td-CBEs變體基因治療的潛能和其精準的特性，研究者評估了其在背景序列含有多個同源多聚胞嘧啶位點的致病單核苷酸變異(SNVs)的編輯情況，這些位點中需要糾正的胞苷處于sgRNA第五位且處于多個連續胞苷中。發現Td-CGBE/Td-CBEs能精準編輯sgRNA第五位的胞苷并產生所需的C-to-G/T轉換，相對于傳統CGBE/CBEs展現出更精準、高效地構建或糾正致病 SNVs位點的能力（圖4）。
圖4：Td-BEs變體糾正人類致病性的SNVs及靶向文庫分析無偏見的評價eTd-CBEs編輯特性
論文共同通訊作者，邦耀生物聯合創始人&副總裁李大力教授表示：“在本次研究中，為了無偏見地分析eTd-CBEs的精準編輯特性，該研究還采用含有8954條sgRNA與靶點配對的文庫進行編輯窗口的分析，證明了其廣泛地精準編輯特性。并且由于其無編輯序列偏好，將來還可以與識別不同PAM的Cas蛋白變體融合，進一步擴大靶向范圍?？偟膩碚f，該項研究創造性地通過蛋白改造，將以腺嘌呤為底物的脫氨酶TadA-8e改造成為僅以胞嘧啶為底物的非天然胞嘧啶脫氨酶，并構建了第一個不依賴AID/APOBEC 脫氨酶家族的新型胞嘧啶堿基編輯系統，其表現出了與BE4max系列編輯器相當的編輯效率，并且編輯窗口更加精準，脫靶率極低，接近背景水平。不僅為未來開發新的堿基編輯技術提供了新思路，更為重要的是有望極大提高將來臨床應用的安全性。”
邦耀生物在單堿基編輯工具開發領域持續發力，助力產品全面布局
作為一家全球最早進行基因編輯技術研發和應用的企業之一，邦耀生物自2013年成立以來，一直堅持技術創新，不僅不斷克服行業壁壘進行多管線戰略布局，同時致力于開發國際領先的基因編輯工具，獲得具有自主知識產權的核心技術。
目前，邦耀生物科學家團隊在基因編輯工具開發、基因治療地中海貧血以及CAR-T技術創新領域，已經取得很多重磅、突破性進展。近1年來，邦耀生物已在國際著名學術期刊Nature、Nature Medicine、Nature Biotechnology、Nature Chemical Biology等發表多篇學術論文，特別是在單堿基編輯工具開發領域的相繼突破，為基礎研究和遺傳性疾病如β-地中海貧血的治療提供了新的發展方向和工具。
對此，論文共同通訊作者，邦耀生物創始人&董事長劉明耀教授表示，“本次高精度新型胞嘧啶堿基編輯系統‘Td-CGBE/Td-CBEs’的開發，是邦耀生物繼開發出ABE9新型腺嘌呤堿基編輯器后在單堿基編輯工具開發領域的又一次革命性創新。此次堿基編輯器的優化升級及安全性的完善，為人類遺傳疾病的基因治療帶來了新希望。而邦耀生物作為一家細胞基因藥企，一直以來都注重在底層基因編輯技術方面不斷探索，著眼于基因藥物和細胞藥物的開發。目前，邦耀生物已與國內多家醫療單位合作，在基因編輯治療β-地中海貧血癥、非病毒PD1定點整合CAR-T、以及UCART等項目中已經取得優異臨床效果。未來，邦耀生物仍將依托堅實的基礎研發實力，不斷地加速推進創新藥物的轉化與落地，造福全球遺傳疾病、惡性腫瘤及自身免疫系統疾病等患者；并致力于改寫和引領中國新一代藥企在全球生命科技領域格局！”
